Последние новости

Мясников рассказал о пользе 3-5 чашек кофе в день
Мужчина, устроивший конфликт в московском автобусе, извинился - 17.01.2022
На западе Москвы автомобиль сбил на пешеходном переходе женщину и ее дочь - 17.01.2022
В Петербурге задержали подозреваемого в насилии над 12-летней девочкой в ТЦ - 17.01.2022
В Приангарье ребенок упал в канализационный колодец - 17.01.2022
Напавшего на пассажиров автобуса жителя Красноярска направили на лечение - 17.01.2022
СМИ назвали возможных причастных к ограблению вдовы Градского - 17.01.2022
В Хакасии выявили первые случаи заболевания "омикроном" - 17.01.2022
В Ноябрьске временно закрыли аэропорт - 17.01.2022
При пожаре в жилом доме в Челябинске погибли три человека - 17.01.2022
ЦРУ учит украинский спецназ убивать русских. Но обвинят Россию - 17.01.2022
Двух жителей Новосибирска заподозрили в изготовлении взрывчатки - 17.01.2022
Главу представительства "Аэрофлота" в Томске заподозрили мошенничестве - 17.01.2022
Раскрыты подробности ограбления вдовы Градского на 100 миллионов рублей - 17.01.2022
В Иркутской области сгорел цех с майнинговыми фермами - 17.01.2022
Песков заявил, что отношения России и НАТО подошли к красной линии - 17.01.2022
Вдову певца Градского ограбили в Подмосковье - 17.01.2022
Смесь: 3 истории на понедельник
В России 5G забрезжил на горизонте — бесплатные частоты и депутаты
Идеальный аксессуар для скрытой слежки — AirTag или SmartTag, проблема умных меток
Бирюльки №677. Облака растут в цене или закрываются, два примера
По делу об инциденте в московском автобусе задержали мужчину - 16.01.2022
Прокуратура поставила на контроль дело о нападении на вдову Градского - 16.01.2022
В Москве в ДТП со скорой пострадали два человека - 16.01.2022
В Подмосковье ограбили вдову Градского, сообщил источник - 16.01.2022
На синей ветке московского метро восстановили движение поездов - 16.01.2022
В Воронежской области в ДТП погибли три человека - 16.01.2022
СК возбудил дело о разжигании вражды после инцидента в московском автобусе - 16.01.2022
На синей ветке московского метро человек упал на пути - 16.01.2022
Прокуратура проверяет сообщения о нападениях волков в Новгородской области - 16.01.2022
В Минводах салют выбил окна в многоэтажке и повредил автомобили - 16.01.2022
Больше новостей

Эффекты фотобиомодуляции импульсного лазера NIR (810 нм) и светодиода (808 ± 3 нм) с идентичным режимом лечения на заживление ожоговой раны: количественный глобальный протеомный подход без меток

Здоровье
331
0

16



Фотобиомодуляция (ФБМ) превратилась в быстрорастущий терапевтический биофизический неинвазивный подход для ускорения восстановления тканей, смягчения боли, воспаления и восстановления клеточных функций. В этом исследовании сравнивается эффект PBM импульсного режима (10 Гц) NIR-лазера (810 нм) и светодиода (808 ± 3 нм) с идентичным режимом лечения (средняя мощность 70 мВт; средняя освещенность 40 мВт / см2; общая плотность энергии 24 Дж. / см2, рабочий цикл 50%; длительность импульса 50 мсек; пиковая мощность излучения 80 мВт / см2; воздействие 10 мин один раз в день в течение 7 дней) на полнослойной ожоговой ране третьей степени у крысы с использованием комплексного количественного анализа глобальной протеомики с последующей проверкой данных протеомики различными биофизическими, биохимическими, молекулярными, гистологическими и иммуногистохимическими (ИГХ) анализами. Протеомный анализ четко выявил общие биологические процессы, на которые указывает модуляция сходных биологических путей (известных как процесс восстановления тканей), связанных с нейрональным (4), метаболическим (10), сосудистым (3), воспалением (4) и передачей клеточных сигналов (12) в группах, обработанных как лазером, так и светодиодами. Проверка протеомного анализа с использованием различных маркеров заживления продемонстрировала ослабленный воспалительный ответ, такой как снижение уровней TNF-α, IL-1β, IL-6, COX-2 (ELISA), усиление клеточной пролиферации (PCNA, TGF-β2), коллаген, накопление ECM ( биохимический, H& E, окрашивание трихромом Массона, анализы IHC), сокращение раны и цитопротекция (анализ TUNEL) в группах, обработанных лазером и светодиодами, по сравнению с контролем. В совокупности данные протеомики выявили ранее известные молекулы, а также новые идентифицированные молекулы после лечения PBM, что расширяет понимание механизмов восстановления тканей. Это исследование убедительно свидетельствует о том, что и лазер, и светодиод в диапазоне длин волн 810 нм в импульсном режиме (10 Гц) одинаково эффективны для потенциального лечения, опосредованного PBM, для ускорения заживления ожоговой раны.


Введение


Заживление ран - это сложный набор сложных событий, которые происходят в четко организованных четырех перекрывающихся каскадах, то есть гемостаз, воспаление, формирование и ремоделирование грануляционной ткани. Функциональное нарушение в этих хорошо организованных взаимосвязанных сериях заживлений приводит к образованию хронических незаживающих ран. Существуют различные патофизиологические состояния, такие как диабет, ишемия, венозная недостаточность, синдром иммунодефицита, недоедание, обморожения и ожоги, которые существенно затрудняют нормальную реакцию заживления. Среди них термические травмы вызывают разрушительные формы дистресса, сопровождающиеся мучительной болью, психологическим дискомфортом и ложатся тяжелым финансовым бременем на систему здравоохранения. В зависимости от степени тяжести ожоги можно разделить на первую, вторую, третью и четвертую степень. Ожоги первой степени называются так, потому что они затрагивают самый верхний слой кожи. Ожоги второй степени разрушают эпидермис и до некоторой степени слой дермы. Ожоги третьей степени проникают глубже в кожу и вызывают термические повреждения слоев эпидермиса, дермы и гиподермы. Ожоги четвертой степени разрушают все слои кожи, могут распространяться на мышцы, сухожилия и кости.


Нарушение заживления ожогов характеризуется нарушением защитного механизма, стойким воспалением, окислительным стрессом, эпидермальным разрушением, сосудистыми повреждениями, усиленным протеолизом, невропатией и септицемией. Сообщается, что в последние годы значительно увеличился уровень смертности, связанной с ожоговой травмой. Было обнаружено, что терапевтические методы, такие как фотобиомодуляция (ФБМ), положительно влияют на заживление различных видов повреждений тканей.


Фотобиомодуляционная терапия (ФБМТ) предлагает безмедикаментозный и нетепловой терапевтический подход для улучшения заживления ран, ослабления воспаления, уменьшения боли, регуляции нейронов и восстановления клеточных функций. PBM имеет дело с фотонно-тканевым взаимодействием, которое в первую очередь зависит от длины волны, когда свет проникает в ткань и поглощается конкретными клеточными хромофорами / фотоакцепторами, однако на этот процесс сильно влияет рассеяние фотонов и преобладание неспецифической ткани. БИК-область (800–1100 нм) света продемонстрировала меньшее рассеяние и эффективные свойства проникновения вглубь биологической ткани, чем видимая область. PBMT широко использует красный и ближний ИК-спектр света в виде когерентных (лазер) или некогерентных (светоизлучающие диоды, светодиоды) источников. Энергия NIR-квантов преимущественно поглощается эндогенным хромофором благодаря согласованию спектров его действия со спектрами поглощения митохондриальных (цитохром с оксидаза; CCO) и немитохондриальных хромофоров. PBM-опосредованная биоактивация внутриклеточных хромофоров вызывает фотофизические и фотохимические реакции, которые дополнительно запускают каскад различных молекулярных сигналов, связанных с пролиферацией, миграцией клеток, клеточной адгезией, ангиогенезом, регуляцией ионных каналов и выживанием клеток.


Сообщалось, что PBM с использованием света 810 нм эффективно улучшает заживление различных видов острых, хронических ран и неврологические функции при черепно-мозговой травме (TBI). Было показано, что PBMT с лазером 830 нм усиливает сокращение раны при поражении кожи на всю толщину и способствует восстановлению ожоговой ткани у мышей. Аналогичным образом в сравнительном исследовании Gupta et al. (2014) сообщили, что скорость восстановления тканей была максимально увеличена в группе, облученной лазером с длиной волны 810 нм, по сравнению с другими длинами волн света (635, 730 и 980 нм) при частичном истирании кожи у мышей. Несколько исследований показали, что импульсная волна (PW) более эффективна, чем непрерывная волна (CW), благодаря периодам гашения PW, которые минимизируют нагрев ткани, тем самым облегчая глубокое проникновение фотона в ткань-мишень. Кроме того, PW-режим также оказался более эффективным, чем CW, при распространенных заболеваниях головного мозга (ЧМТ, инсульт и психические заболевания) и процессах заживления ран. Точно так же мы также наблюдали многообещающий эффект PW-режима по сравнению с CW, где PBM с импульсным лазером 810 нм (10 Гц) способствует клеточной пролиферации, накоплению ECM, ремоделированию тканей, активации биоэнергетики и подавляет чрезмерное воспаление, что, следовательно, приводит к усилению репарации кожи у крыс с ослабленным иммунитетом.


В последние несколько лет светодиоды широко используются для PBMT из-за его уникальных характеристик, таких как простота использования, стабильная работа, меньшие нормы безопасности, чем у лазера, устойчивость к вибрации, возможность носить носимое устройство, в среднем более низкая стоимость, чем у лазера (на мВт) наряду с освещением большой площади ткани. Основное различие между лазером и светодиодом связано со свойством когерентности света и полосой пропускания. Лазерные источники генерируют когерентный свет (монохроматический) в очень узкой полосе пропускания, однако светодиодные устройства излучают некогерентный свет в полосе пропускания 1–3 нм. Есть некоторые исследования, в которых описывается незначительный эффект PBM при использовании светодиода по сравнению с лазером и подчеркивается необходимость свойства когерентности света для достижения положительного результата PBM. Напротив, в некоторых известных статьях интересно восклицалось, что для успешного исхода фотобиологического явления свойство когерентности света не обязательно желательно. В последние годы терапевтическое применение PBM с использованием светодиодов неожиданно расширилось благодаря его многообещающей эффективности, о которой сообщалось во многих исследованиях. Кроме того, терапевтическое применение PBM с использованием как лазера, так и светодиода показало благоприятный результат для лечения плохо заживающих ран. В сравнительном анализе PBM с использованием лазерных и светодиодных источников на 660 нм и 635 нм соответственно Campos et al. (2016) наблюдали, что оба источника света были одинаково эффективны в снижении уровня TNF-α и, как следствие, орального мукозита. Аналогичным образом, в другом исследовании было показано, что лазер (780 нм) и светодиод (850 нм) эффективно ослабляют воспалительную инфильтрацию в височно-нижнечелюстном суставе крыс. Кроме того, было показано, что лазер (635 нм) и светодиод (623 нм) существенно способствовали закрытию ран и улучшали гистологические показатели диабетических кожных ран у крыс.


Протеомический анализ - это высокопроизводительный и мощный метод, который исследует профиль экспрессии белка, идентифицирует несколько целей в биологическом процессе и обеспечивает новое понимание регуляции клеточных процессов. Традиционный метод не может понять передачу клеточных сигналов на системном уровне, и это ограничение эффективно преодолевается с помощью протеомического подхода. С последнего десятилетия многочисленные исследования с использованием инструментов геномики и протеомики достигли феноменального прогресса и расширили возможности для понимания патофизиологии различных медицинских показаний. Протеомика в настоящее время используется для лучшего исследования сложных механизмов и биомаркеров, связанных с клеточными биологическими механизмами.


При сравнительном исследовании лазера и светодиода появилось несколько свидетельств, показывающих, что оба они одинаково эффективны при лечении различных повреждений, однако количественный безметочный глобальный протеомный анализ заживления кожных ожогов, вызванных PBM, с использованием лазера NIR и светодиодных устройств в 810 нм диапазон длин волн остается в значительной степени неизученным. Подход комплексного протеомного анализа дает возможность установить терапевтический потенциал PBM с использованием импульсного лазера и светодиодного света, что может расширить наше понимание молекулярных механизмов заживления ожоговых ран, опосредованных PBM. Таким образом, настоящее исследование направлено в первую очередь на сравнение лечебной эффективности как NIR-лазера (810 нм), так и светодиода (808 ± 3 нм) в импульсном режиме (10 Гц) с идентичными оптимизированными параметрами оптического излучения (40 мВт / см2; 24 Дж. / см2) на полную толщину ожога третьей степени с помощью глобального протеомного анализа без меток. Кроме того, вторичной целью этого исследования является проверка результатов протеомических данных с использованием различных биофизических, биохимических, молекулярных, гистологических и иммуногистохимических анализов.


Материалы и методы


Животные


Исследование на животных было одобрено Институциональным комитетом по этике животных (IAEC / DIPAS / 2017,14) в соответствии с руководящими принципами CPCSEA, правительства Индии. Самцы крыс Sprague-Dawley весом 180 ± 20 г были взяты из центрального зоопарка Института физиологии и смежных наук Министерства обороны США (DIPAS). Животных содержали в птичнике, поддерживали в стандартных условиях 12 ч: 12-часовой цикл свет / темнота, температура: 25 ± 1 ° C, содержали индивидуально в отдельных стерильных клетках и обеспечивали свободный доступ к еде и воде.


Создание ожоговой раны


Животных анестезировали внутрибрюшинным введением коктейлем из кетамина (90 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг) и сбривали волосы на спине с помощью электрического триммера. Спинную поверхность крысы очищали с использованием 70% спирта и создавали полнослойную трансдермальную ожоговую рану третьей степени, как описано ранее. Вкратце, круглый металлический зонд, нагретый до температуры 85 ° C и имеющий диаметр 1,5 см, прикладывали на 20 с к спинной поверхности крысы с последующей реанимацией. Крысам вводили бупренорфин по мере необходимости после ожоговой травмы. Через 24 часа после индукции ожога кожу иссекали путем удаления мертвой ткани с помощью стерильных щипцов и ножниц в асептических условиях. Ожоговая рана оставалась открытой на протяжении всего эксперимента. Через семь дней после ранения крыс умерщвляли путем инъекции передозировки тиопентала (90 мг / кг массы тела, внутрибрюшинно), и ткани раны были точно собраны для количественного глобального безметочного протеомного, биохимического, молекулярного, количественного анализа ELISA, гистопатологии и иммуногистохимии.


Схема эксперимента и обработка PBM


Были отобраны 42 крысы и рандомизированы на две группы. Первая группа, содержащая 4 подгруппы по 6 крыс в каждой: необлученный контроль ожога (имитация воздействия), лазер 810 нм в режиме PW (10 Гц), светодиод 808 ± 3 нм в режиме PW (10 Гц) и сульфадиазин серебра, SSD (1%, Ranbaxy, Индия) (справочная помощь). Вторая группа состоит из 3 подгрупп по 6 крыс в каждой, а именно контроль ожога без облучения (имитация воздействия), лазер 810 нм в режиме PW (10 Гц) и светодиод 808 ± 3 нм в режиме PW (10 Гц). Облучение светом было выполнено с использованием идентичных оптимизированных параметров оптического облучения как для лазера ближнего инфракрасного диапазона (810 нм, диод Al-Ga-As), так и для светодиодного света (808 ± 3 нм) при плотности энергии 24 Дж / см2 и освещенности 40 мВт / см2 в режиме PW 10 Гц с 50% рабочим циклом в течение 10 минут ежедневно в течение семи дней после ранения. Освещенность измеряли с помощью измерителя мощности / энергии. Контрольную группу ожогов (необлученную) оставили для естественного заживления. Животных первой группы использовали для мониторинга сокращения области раны, про-репаративных маркеров (ДНК, общий белок, уровни гидроксипролина и гексозамина) и гистопатологического анализа (окраска H&E). Животных второй группы использовали для количественного анализа ELISA, связанного с воспалительными маркерами, а именно TNF-α, IL-1β, IL-6, COX-2, гистологическое окрашивание трихромом Массона (MT), анализ мечения ник-концов терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP (TUNEL), иммунофлуоресцентное окрашивание, относящееся к маркерам пролиферации клеток (PCNA и TGF-β2 ) и количественный глобальный протеомный анализ без меток.


Количественный глобальный протеомный анализ без меток


Количественная протеомика - это сложная аналитическая технология, которая в настоящее время используется для исследования всесторонней экспрессии белков различных клеточных состояний, биомаркеров болезней и обнаружения целей. Для протеомного анализа белки экстрагировали из собранной ткани раны с использованием буфера RIPA, и для переваривания использовали образец белка 500 мкг. Образцы разбавляли 50 мМ NH4HCO3 и подвергали реакции со 100 мМ DTT при 95 ° C в течение 1 часа с последующей обработкой 250 мМ IDA и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 45 минут. После инкубации добавляли трипсин и оставляли на ночь при 37 ° C. После этого образцы сушили в вакууме и затем растворяли в 50 мкл 0,1% муравьиной кислоты в воде с последующим центрифугированием при 13000 g. Собранный супернатант загружали во флакон и 10 мкл образца вводили в колонку C18 UPLC для разделения пептидов с последующим анализом на приборе Q-TOF для МС и МСМС. После сбора данных необработанные данные были проанализированы с помощью MassLynx 4.1 WATERS. Впоследствии необработанные файлы, полученные из вышеупомянутых протоколов, были оценены на предмет идентификации и экспрессии белков с помощью WATERS Protein Lynx Global Server-PLGS, версия 3.0.2. Список индивидуальных пептидных пиков, основанный на их значении m / z, был найден в базе данных, содержащей последовательности для белков (крыса), и сопоставлен на основе вероятностей совпадения пептидов с использованием сервера PLGS.


Биоинформатический анализ


Собранные данные были подвергнуты нескольким стратегиям анализа, чтобы вывести биологическую информацию, скрытую в сигнатурах экспрессии белков, после облучения импульсным (10 Гц) лазером (810 нм) и светодиодом (808 ± 3 нм). Biovenn (https://www.biovenn.nl/) использовался для построения диаграммы Венна между различными группами, чтобы сделать вывод об общей и уникальной модуляции белка. Мы использовали ресурсы биоинформатики DAVID (пути KEGG, p <0,01) для функциональной аннотации Clustering, Pathway Mining и Gene Ontology (GO).


Анализ про-репаративных маркеров


Фотосъемку (Nikon Coolpix S3400) размера раны проводили в день ожогового ранения (день 0), а затем на четвертый и восьмой день после ранения. Сокращение области раны исследовали на цифровых фотографиях, как описано ранее. Для анализа скорости сокращения раны использовали программное обеспечение Fiji (ImageJ) (NIH, США). Значения выражены в мм2. Ткани раны собирали через 7 дней после ранения и использовали для анализа про-репаративных маркеров, таких как уровни ДНК, белка, гидроксипролина (HP) и гексозамина (HA), в соответствии с методом, описанным ранее.


ИФА анализ провоспалительных и болевых маркеров


Содержание TNF-α, IL-1β, IL-6 и COX-2 определяли количественно с использованием набора для сэндвич-ELISA в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, собранную ткань гомогенизировали в буфере RIPA и центрифугировали. Супернатант добавляли в планшеты для ELISA и позволяли инкубировать в течение 2 часов (TNF-α при комнатной температуре, RT); 2,5 ч (IL-1β, IL-6 при комнатной температуре); 1,5 ч (СОХ-2 при 37 ° С). После инкубации добавляли соответствующие специфические антитела крысы (конъюгированные с биотином) и дополнительно инкубировали в течение 1 ч (TNF-α, IL-1β и IL-6 при комнатной температуре); 1 ч (СОХ-2 при 37 ° С). После этого планшеты снова инкубировали с конъюгатом HRP в течение 30 мин (TNF-α при комнатной температуре); 45 мин (IL-1β, IL-6 при комнатной температуре); 30 мин (СОХ-2 при 37 ° С). Наконец, в планшеты для ELISA добавляли раствор субстрата с последующим добавлением стоп-раствора для прекращения реакции и измеряли интенсивность проявившейся окраски при 450 нм. Значения были представлены в пг / мл / мг белка.


Гистопатологический анализ


Ткань раны для окрашивания H&E и MT собирали на восьмой день после ранения и фиксировали в забуференном формалине (10%). Срезы тканей были обезвожены с использованием серии градуированных спиртов и очищены с использованием ксилола с последующим погружением в парафиновый воск. 4 мкм залитой парафином кожной ткани вырезали и окрашивали окрашиванием H&E и MT. Окрашивание H&E проводили по методике, описанной ранее. Окрашивание МТ проводили с использованием имеющегося в продаже набора (# HT15, Sigma) в соответствии с инструкциями производителя. Срезы, окрашенные H&E и MT, контролировали на предмет гистопатологических изменений, таких как воспаление, фиброз, характер отложений коллагеновых волокон, ангиогенез и реэпителизацию, под светлопольным микроскопом с последующей микрофотографией.


TUNEL анализ


Залитые в парафин срезы ткани кожи (4–5 мкм) депарафинизировали и подвергали анализу TUNEL с использованием набора для анализа фрагментации ДНК Apo-BrdU-IHC in-situ в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, депарафинизированные и регидратированные срезы ткани последовательно подвергали обработке протеиназой K и перекисью водорода (H2O2) с последующей инкубацией с реакционной смесью для мечения, содержащей терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT) и бромдезоксиуридинтрифосфат (Br-dUTP) в течение 1–1,5. час Затем срезы инкубировали с блокирующим раствором с последующей инкубацией антител против BrdU-биотина в течение 1–1,5 ч, которые затем зондировали буферным раствором конъюгата HRP-стрептавидин. Наконец, срезы промывали, проявляли раствором DAB / H2O2, окрашивали ядерным красителем метиловым зеленым и закрывали покровным стеклом, используя маунтант DPX. Отрицательные контроли обрабатывали путем исключения фермента TdT в смеси для маркировки. Окрашенные срезы исследовали и изображения получали с помощью светлопольного микроскопа.


Иммуногистохимический (ИГХ) анализ


Залитые парафином срезы ткани кожи депарафинизировали и очищали в ксилоле в течение 5-10 минут с последующей постепенной гидратацией путем пропускания через уменьшающуюся концентрацию спирта, то есть 100%, 90%, 70%, 50%, 30% этанола и деионизированной воды (по 3 минуты каждый). Срезы выдерживали в растворе для поиска антигена (натрий-цитратный буфер) в течение 20 мин. После извлечения антигена срез ткани подвергали проницаемости с использованием Triton-X-100 (0,1%). Блокировку проводили с использованием козьей сыворотки (10% в PBS) при 37 ° C в течение 30 мин. Затем срезы зондировали первичным антителом в разведении 1: 250 в течение ночи при 4 ° C с последующей инкубацией с меченным флуоресценцией вторичным антителом в разведении 1: 500 в темноте в течение 1 часа при комнатной температуре. Использовали следующие специфичные для крыс первичные антитела: PCNA (поликлональный кролик # af0239, Affinity biosciences) и TGF-β2 (поликлональный козий # T4442, Sigma Aldrich). Помеченные флуоресценцией вторичные антитела (# R37117 Alexa Fluor-595 козьих антител против кроличьего IgG и # A11078 Alexa Fluor-488 кроличьих антител против козьих IgG) были получены от Invitrogen, CA. Срезы промывали с помощью PBS и закрывали установочной средой, содержащей диамидино-2-фенилиндол (DAPI) (Prolonged Diamond Antifade Mountant with DAPI, # P36962, Invitrogen CA). Флуоресцентные изображения получали с помощью микроскопа темного поля (Nikon Eclipse Ti2, США) с использованием фильтров TRITC, FITC и DAPI. Захваченные изображения накладывались друг на друга, и сигнал интегральной интенсивности флуоресценции количественно оценивался с использованием программного обеспечения Fiji (ImageJ).


Статистический анализ


Значения выражены в виде среднего ± стандартная ошибка. Односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с апостериорным критерием Даннета использовали для определения статистической значимости между контрольной и экспериментальной группами. Весь анализ проводился с использованием программы GraphPad Prism (версия 6.0, США). Статистически значимым считали р <0,05.


Полученные результаты


Количественный глобальный протеомный анализ без меток


Чтобы определить молекулярную основу PBM с использованием лазерного (810 нм) и светодиодного (808 ± 3 нм) излучения света с импульсной частотой 10 Гц, мы выполнили протеомику без метки (LFP) и количественно оценили дифференциально экспрессируемый белок. LFP - это высокопроизводительная технология для определения дифференциально экспрессируемых белков, обладающих огромным потенциалом для выявления множества молекулярных сигналов, связанных с восстановлением тканей. Как и ожидалось, облучение импульсным лазером 810 нм вызвало широкий ответ с 727 дифференциально экспрессируемыми белками, из которых 333 были активированы, а 394 - подавлены. Точно так же световое облучение LED (808 ± 3 нм) приводило к дифференциальной экспрессии всего 822 белков, из которых 482 белка были активированы, а 340 белков подавлены. Эти анализы показывают более высокое сходство между группами лазеров и светодиодов. 187 общих белков были нарушены в обоих режимах облучения. Кроме того, мы использовали различные инструменты биоинформатики и идентифицировали различные биологические пути в нашем состоянии. Примечательно, что наш результат продемонстрировал объединяющую биологическую тему, возникающую из независимых инструментов биоинформатики. Этот анализ показал новое молекулярное понимание процесса восстановления тканей в ранах, облученных лазером и светодиодами. Список Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) обогатил ключевые биологические пути, извлеченные с использованием ресурсов биоинформатики DAVID для систематического и комплексного анализа набора данных как лазерных, так и светодиодных групп. Всего 78 значимых путей KEGG было обнаружено в группе, облученной лазером, с другой стороны, 68 путей пути KEGG были обнаружены в группе, облученной светодиодом.


Пути, которые модулируются в группе, подвергшейся лазерному облучению, включают, в первую очередь, вовлеченные в основные группы, такие как нейрональные (активная регуляция 36 протеинов и пониженная регуляция 47 протеинов), метаболические (57 протеинов позитивная регуляция и 83 пониженная регуляция), сосудистые (23 протеина повышенная регуляция и 30 протеинов с пониженной регуляцией), воспалением (17 протеинов с усиленной регуляцией и 24 протеинами с пониженной регуляцией), клеточной сигнализацией (57 протеинов с повышенной и 65 пониженной регуляцией) и связанными с раком (14 протеинов с повышенной и 18 пониженной регуляцией). Точно так же мы классифицировали путь, модулированный после облучения светодиодами. Мы обнаружили, что все основные группы похожи на группу, подвергшуюся лазерному облучению, они являются нейрональными (31 белок положительно регулируется и 39 белков отрицательно регулируется), метаболические (85 белков положительно регулируются и 64 белка подавляются), сосудистые (21 белок положительно регулируется и 15 белков подавляется), воспаление (33 белка положительно регулируются и 14 белков подавлены), клеточной сигнализации (45 белков положительно регулируются и 36 белков подавлены) и связаны с раком (29 белков положительно регулируются и 22 белка подавляются). Примечательно, что 43 пути являются общими для групп лазеров и светодиодов. Наши объединенные результаты показывают сходство в ответе, что показано путями и белками, модулированными после лазерного и светодиодного облучения. Мы также получили сеть коэкспрессируемых генов с использованием Gene MANIA. Этот анализ выявил дополнительные поразительные аспекты, связанные с биологическими путями в группах, облученных лазером и светодиодами. Большинство общих сетей были связаны с метаболическим путем, сигнальным путем клеток, окислительно-восстановительным сигнальным путем и сосудистым процессом.


PBM усиленное сокращение раны


Визуальная оценка ран, облученных PBM, показала прогрессирующую реэпителизацию без признаков отека, кровотечения и раневого экссудата. PBM с лазерным (810 нм) и светодиодным (808 ± 3 нм) облучением с частотой PW 10 Гц продемонстрировал улучшенное заживление, о чем свидетельствует значительно более быстрое сокращение раны (43% и 48% соответственно, p <0,05) на 8-й день после ранения с контролем ожога. Однако мы не обнаружили значительной разницы в скорости сокращения ран между группами, облученными лазером и светодиодами. Кроме того, группа референтной помощи (SSD) не показала каких-либо значительных изменений в сокращении области раны.


PBM увеличивает прорепаративные биохимические маркеры


Обработка PBM значительно (p <0,05) увеличивала пролиферацию клеток, накопление и стабилизацию коллагена как в группе лазера, так и в группе светодиодов, что проявлялось в увеличении ДНК (30% и 26% соответственно), общего белка (38% и 42% соответственно), HP ( 60% и 63% соответственно) и HA (56% и 47% соответственно) по сравнению с контролем ожога. Однако лечение SSD не показало значительных изменений про-репаративных маркеров по сравнению с контролем.


Аттенуированные воспалительные маркеры PBM


ELISA использовали для количественной оценки уровня провоспалительных маркеров, а именно TNF-α, IL-1β, IL-6 и COX-2. Облучение лазером и светодиодом показало значительное (p <0,05) снижение TNF-α (22% и 23% соответственно), IL-1β (24% и 26% соответственно), IL-6 (64% и 73% соответственно) и содержание СОХ-2 (32% и 24% соответственно) по сравнению с контролем ожога. Напротив, не наблюдалось значительной разницы в провоспалительных маркерах между группами импульсного лазера и светодиодов.


Гистопатологическое исследование


Обнаружение окрашивания H&E показало, что лечение импульсным лазером и светодиодами было эффективным при заживлении ожоговых ран кожи у крыс. Гистопатологическое исследование показало прогрессирующую пролиферацию фибробластов, ангиогенез и заметную миграцию эпидермиса с незначительной инфильтрацией воспалительных клеток, уменьшение скопления и отека в ране, обработанной как лазером, так и светодиодами, по сравнению с контрольной группой ожогов. Наоборот, контроль ожогового контроля и исследование среза ткани, обработанной SSD, показали обнаженный эпителий, отек, разбросанные клетки фибробластов, снижение ангиогенеза и стойкую инфильтрацию воспалительных клеток в ложе раны через семь дней после ранения. Окрашивание МТ проводили для изучения степени накопления коллагена в грануляционной ткани раны. Обработка импульсным лазером и светодиодами привела к значительному увеличению накопления коллагена, о чем свидетельствует хорошо выровненное, плотно упакованное, толстое и параллельное расположение коллагеновых волокон. В то время как в необлученной ране для борьбы с ожогами наблюдалось пониженное накопление коллагена, неплотно упакованные тонкие волокна с нерегулярным рисунком. Тест TUNEL проводили для наблюдения за распределением апоптотических клеток в регенерированной ткани. После визуализации TUNEL-положительные клетки были окрашены в коричневый цвет по контрасту с зеленым фоном (обеспечиваемым контрастным окрашиванием метиловым зеленым). Результат показал усиление апоптоза (увеличение количества апоптотических клеток) в необлученной контрольной группе с ожогами; однако лечение импульсным лазером и светодиодами уменьшало апоптоз клеток (несколько апоптозных клеток). В целом, эти результаты ясно показывают, что лечение как импульсным лазером NIR (810 нм), так и лечением светодиодами (808 ± 3 нм) имеет эквивалентную эффективность заживления ожоговых ран у крыс.


PBM модулирует экспрессию PCNA и TGF-β


Количественный анализ интенсивности иммунофлуоресценции показал значительную (p <0,05) повышенную экспрессию PCNA (33% и 31% соответственно) и TGF-β2 (45% и 41% соответственно) в тканях с грануляциями ран, обработанных лазером и светодиодами, по сравнению с ожоговым контролем. Соответствующие графики поверхности с пиками, представляющими экспрессию PCNA и TGF-β2 в группах контроля ожога, импульсного лазера и светодиодов. Не наблюдалось различий в экспрессии маркеров пролиферации между группами, облученными импульсным лазером и светодиодами.


Обсуждение результатов


Кожа - самый крупный и один из важных органов тела, который играет жизненно важную роль в терморегуляции, гомеостазе жидкостей организма и действует как барьер против внешней среды. Ожог кожи делает организм предрасположенным к микробным инфекциям, а также к сепсису, ограничению кровоснабжения сосудов и подавлению иммунитета. Нарушение и замедленное заживление ожоговых ран происходит из-за потери синхронизации фаз восстановления тканей. Было показано, что ожоговые травмы связаны с бесчисленными осложнениями, которые составляют серьезную проблему для здравоохранения во всем мире.


О терапевтических преимуществах PBM-опосредованных лазеров и светодиодов хорошо сообщалось с 1960-х и 1990-х годов соответственно. В последние годы светодиодная технология значительно расширилась благодаря явлению фотонной интерференции, которое обеспечивает более высокую интенсивность фотонов и максимальную длину волны, чем в старшем поколении, что делает ресурсы светодиодов пригодными для терапевтического и диагностического применения. PBM с использованием светодиода на оптимальной длине волны и параметрах теперь хорошо продемонстрирован в различных исследованиях in vivo и in vitro, в которых изучаются его потенциальные положительные эффекты с использованием длин волн красного и ближнего инфракрасного света для ускорения заживления острых и хронических ран. В этом контексте было обнаружено, что PBM со светодиодным красным светом (630 нм) ускоряет заживление раны, способствуя пролиферации фибробластов, эпидермальных и эндотелиальных клеток в модели раны кожи кролика. Аналогичным образом Whelan et al. сообщили, что PBM с обработкой светодиодами NIR 880 нм увеличивал скорость закрытия ран и повышал уровень FGF-2 и VEGF, что приводило к усиленному заживлению кожной ишемической раны у крыс. Также было замечено, что лечение когерентным (лазер 660 нм) или некогерентным (светодиод 640 нм) светом дает идентичные положительные эффекты для уменьшения диаметра области раны у диабетических крыс. В другом исследовании De souse et al. продемонстрировали, что оба лазера на длинах волн 660, 790 нм и светодиоды на длинах волн 530 ± 20 нм, 700 ± 20 нм существенно увеличивают ангиогенез in vivo на кожной ране у крыс.


Наши более ранние исследования показали, что PBM с лазером 810 нм в импульсном режиме (10 Гц) преимущественно уменьшал преувеличенный воспалительный ответ, стимулируя пролиферацию клеток, миграцию, неоваскуляризацию, реэпителизацию, активацию биоэнергетики, накопление коллагена, стабилизацию ECM и ремоделирование тканей, чтобы повернуть ускоренное заживление кожных ран у крыс с подавленным иммунитетом. Кроме того, мы дополнительно исследовали молекулярные аспекты PBM с помощью лазера 810 нм в импульсном режиме (10 Гц), который положительно регулирует клеточную пролиферацию и выживание посредством Ca2 + -кальмодулина, Akt, ERK, каскадов редокс-сигналов. Он также снижает окислительный стресс, облегчает боль и воспаление и подавляет апоптоз, что может улучшить процесс заживления кожных ран у крыс с ослабленным иммунитетом. С этой разработкой в ​​настоящем исследовании сравнивалась эффективность восстановления тканей лазерным (810 нм) и светодиодным (808 ± 3 нм) светом в импульсном режиме (10 Гц) с идентичными параметрами облучения на полнослойной трансдермальной ожоговой ране у крыс с помощью с использованием комплексного анализа количественной глобальной протеомики без меток с последующей проверкой данных протеомики с использованием биофизических, биохимических, ELISA, гистопатологических и иммуногистохимических анализов для маркеров, связанных с пролиферацией клеток, цитопротекцией, отложением ECM и воспалительным ответом.


Результаты текущего исследования продемонстрировали, что PBM с импульсным светом 810 нм (10 Гц) с использованием лазера или источника светодиода в равной степени способствовал заживлению кожных ран, о чем свидетельствует усиленная пролиферация клеток, реэпителизация, ангиогенез, накопление коллагена и ослабление воспалительных реакций.


Количественный глобальный протеомный анализ без меток четко очерчивает нарушения определенных белков, имеющих отношение к процессу восстановления тканей. Дифференциально выраженное профилирование протеома после облучения лазером и светодиодами оказалось неотъемлемым компонентом биологических сетей, регулирующих процессы восстановления тканей, включая окислительно-восстановительную передачу сигналов, клеточный метаболизм, регуляцию нейронов, сосудистую и клеточную передачу сигналов. В таких биологических сетях пять дискретных путей были легко различимы в группах, облученных PBM, включая воспаление, пути связывания рецептора фактора роста, путь миграции клеток, путь клеточной адгезии, путь передачи сигналов кальция и путь ремоделирования ткани, что привело к обнаружению молекулярных паттернов, связанных с терапией. Примечательно, что эти процессы идентифицировали широко распространенные маркеры и различные другие новые белки, такие как воспаление (TNF, TLR4, CXCL10, FAS), передачу сигналов и пролиферацию клеток (IGF, TGF, FGF, PDGF, MAPK, ErbB, IP3, JAK2, mTOR, Rap1 , Ras, cAMP, cGMP, PKG), миграцию клеток и клеточную адгезию (cdc42ep1, MCam, CSF1R, JAM3, JUP, NCAM), светочувствительный ионный канал (TRPV, ASIC1), ремоделирование ткани (ERRB3, ENPP1, MMP2, MMP9 ), неоваскуляризацию (PI3K, AKT, HIF-1α, FOXO, VEGF, NOS3), метаболические реакции (ACOX1, HMGCR, ACSL5, G6PC3), биоэнергетику (AMPK, ADCY2) и сигнальные пути, регулирующие плюрипотентность (CTNNB, BMP1), ACV улучшили восстановление и регенерацию тканей и, таким образом, подтвердили специфичность опосредованных PBM ответов в нашем исследовании. Взятые вместе, лазерное и светодиодное излучение модулируют интегрированный ключевой клеточный путь, центрально связанный с процессом заживления.



0 комментариев